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CIÊNCIA & TECNOLOGIA - Trabalhos Técnicos

Saúde Avicola

Influenza Aviária Aspectos Epidemiológicos

Martins, N. R. da Silva Definição Influenza aviária (IA) é doença infecciosa viral altamente contagiosa causada pelos vírus da influenza aviária (AIV), integrantes de Orthomyxoviridae, do gênero Influenza A, de patogenicidade intravenosa maior que 1,2 (aves SPF de seis semanas), ou causada por AIV dos subtipos H5 ou H7, ou estirpes cuja glicoproteína da fusão (em HA2) apresente o sítio de clivagem com seqüências de múltiplos aminoácidos básicos. Exótica para avicultura industrial brasileira, de notificação e erradicação obrigatórias, está classificada no grupo A de doenças da O.I.E. Etiologia ** Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de AIV: o envelope contém projeções superficiais; Fonte: Linda M. Stannard, 1995. Os AIV são classificados em Orthomyxoviridae no gênero Influenza A. Os gêneros Influenza B e C da família ocorrem em humanos. Nomenclatura de classificação Os AIV são identificados com sistema que permite a descrição das características principais do isolado, incluindo a identificação do gênero do vírus (A, B ou C), espécie hospedeira, localização geográfica, número de referência laboratorial, ano de isolamento e subtipo de HA e de NA (ex.: A/Environment/Hong Kong/437/99/H5N1). Composição Estes são os componentes estruturais ordenados de dentro para fora do vírion: Ácido nucléico RNA de fita simples; Nucleoproteína (forma o nucleocapsídio em torno do RNA); M1 (forma pontes entre a nucleoproteína e as glicoproteínas do envelope). No envelope de dupla camada lipídica estão as proteínas inseridas: M2 (forma poros no envelope, para a passagem de íons durante a liberação da ribonucleoproteína); hemaglutinina (HA), que forma as projeções superficiais mais finas e neuraminidase (NA), que forma as projeções superficiais em forma de pirulito (Fig. 1 e 2). Como nos demais integrantes de Orthomyxoviridae, os AIV têm envelope de dupla camada lipídica que contém proteínas inseridas. Estas determinam a virulência e o tropismo dos AIV, por terem maior ou menor afinidade com antígenos receptores nas células hospedeiras. A hemaglutinina – HA (500/vírion) tem as funções de adsorção (área antigênica B de HA1 – cabeça da HA) aos receptores (ácido N-acetil neuramínico ou siálico da glicoproteína receptora da célula) celulares e fusão (eixo ou haste de HA2) à membrana citoplasmática e neuraminidase (100/vírion) tem a função de liberação (remoção de ácido siálico da HA) das partículas de vírus que emergem da célula (brotamento), remoção de mucopolissacarídios inibidores da HA e penetração no muco epitelial. Na região interna do vírion, o cerne, aproximadamente 1000 unidades da nucleoproteína formam um envoltório protetor (capsídio) do genoma (RNA). A replicação dos influenza vírus inclui as seguintes etapas: 1. adsorção e endocitose; 2. abaixamento do pH nos endossomos; 3. ativação do poro iônico; 4. entrada dos íons H+; 5 e 6. Fragilização dos contatos M1-RNP e M1-HA; 7. mudança conformacional na HA; 8. translocação da região hidrofóbica da HA2; 9. fusão da HA e dupla camada lipídica do endossomo; 10. liberação da RNP para o citoplasma; 11. migração da RNP para o núcleo; 12. transcrição do RNA no núcleo celular; 13. tradução do RNAm no retículo endoplásmico rugoso (RER); 14. maturação no aparelho de Golgi; 15. inserção das proteínas do envelope na membrana celular; 16. brotamento. Programa Nacional de Sanidade Avícola A IA é doença enquadrada no grupo A de epizootias da O.I.E., de notificação obrigatória no país, para atender as exigências internacionais. É doença exótica no Brasil e o Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) mantém monitorização permanente das aves das principais espécies domésticas, tanto material genético importado para a indústria avícola (Gallus gallus formadomestica, Meleagris gallopavo formadomestica, Coturnix coturnix japonica, Anas anas, entre outras), primários (elite), bisavós e avós para postura ou corte, como espécies em exploração comercial mais recente Struthio camelus (exótica) ou Rhea americana (nativa). Os reprodutores são acompanhados por amostragens periódicas, conforme previsto no PNSA e preconizado pela O.I.E., em iniciativa da própria indústria, beneficiada diretamente pela certificação oficial de qualidade. Nos plantéis industriais a saúde é fundamental para o desempenho, sendo esta avaliada por monitorização permanente quanto a seus reflexos na viabilidade econômica e qualidade. Neste contexto, os plantéis industriais são freqüentemente examinados, especialmente os reprodutores, por exemplo, quanto às respostas aos programas de vacinação, tais como, contra bronquite infecciosa, doença de Newcastle e doença infecciosa bursal, entre outras, e examinados também em microbiologia, comumente quando há queda em produtividade, para a identificação de agentes de infecções. As informações sobre infecções/doenças e títulos de anticorpos têm assim valor estratégico permitindo o acompanhamento dos plantéis e disponibilizando histórico epidemiológico da indústria avícola. O PNSA estabelece as normas de atuação para o controle e erradicação da IA (junto com a doença de Newcastle - ND) no Projeto de Vigilância Ativa (Projeto de Vigilância..., 2001), que são: 1.Notificação de focos da doença (e confirmação laboratorial no LARA-Campinas); 2. Assistência a focos; 3. Medidas de desinfecção; 4. Sacrifício sanitário; 5. Vazio sanitário; 6. Vacinação dos plantéis ou esquemas emergenciais; 7. Controle e fiscalização dos animais susceptíveis; 8. Outras medidas sanitárias; O atendimento ao foco, de acordo com as normas do PNSA, prevê a (1) interdição e coleta de materiais para exame laboratorial oficial; (2) registro das aves por espécie(s), categoria(s) e número(s); (3) manutenção de aves, utensílios e produtos no local; (4) proibição de trânsito de e para a(s) propriedade(s) em um raio de 10 km; (5) controle de todos os animais e materiais possíveis fontes de propagação; (6) desinfecção de vias de entradas e saídas à(s) propriedade(s); (7) inquérito epidemiológico; (8) confirmação laboratorial: isolamento de agente letal hemaglutinante em ovos embrionados de galinhas SPF, não inibido (inibição da hemaglutinação) ou não neutralizado (soroneutralização) por soro específico para o vírus da doença de Newcastle; (9) caracterização do agente como vírus da influenza aviária (AIV) por detecção de antígenos da nucleoproteína e/ou matriciais de AIV e de seu subtipo por ensaios específicos para a caracterização da hemaglutinina e neuraminidase (imunodifusão, imunoenzimáticos ou moleculares); (10) abate e destruição imediata (cremação) de todas as aves, resíduos, carnes e ovos da(s) propriedade(s) atingida(s) e vizinhas (raio de 3 km); (11) limpeza e desinfecção das instalações; vazio sanitário (mínimo 21 dias); (12) permitir o transporte para o abate ou incubação dentro da zona de vigilância (raio de 10 km); (13) proibir feiras, exposições, mercados na zona de vigilância (10 km); (14) aplicar estas medidas por mínimo de 21 dias após a destruição das fontes de propagação e desinfecção das instalações, proibir a retirada de aves e produtos na zona de proteção (3 km) por 21 dias e 15 dias na zona de vigilância (10 km). Office International des Epizooties A certificação de área livre segue as normas da OIE (e PNSA), considerando IA exótica no Brasil (país livre) e exige que IA de alta patogenicidade não seja diagnosticada pelo sistema de vigilância pelos últimos 3 anos e submete após surto a um período de 6 meses após o abate, destruição das aves e resíduos e desinfecção. Risco de Influenza Aviária no Brasil A avicultura industrial de galinhas e perus no Brasil emprega alta tecnologia e conhecimento científico na produção, na qual os plantéis são gerenciados com biossegurança, avaliação permanente dos pontos críticos e sistema de qualidade total, incluindo programas de vacinação e estratégias para a prevenção de problemas sanitários. A prevenção de influenza aviária é especialmente favorecida por estas características de manejo. Por exemplo, frangos de corte e cria/recria de poedeiras são desenvolvidos em galpões, cujo alojamento dos plantéis dificulta o desafio eventualmente imposto pelas aves de vida livre, além de reduzir a exposição às aves migratórias. As rotas migratórias das aves reservatório, por sua vez, podem também exercer papel no menor risco de influenza nas aves comerciais do Brasil, por não coincidirem com a geografia da avicultura industrial. Outra informação interessante é o baixo índice de replicação dos AIV nas aves migratórias durante a passagem pela região subtropical. Outras espécies de aves domésticas de importância comercial mais sensíveis à infecção e potencialmente envolvidas no papel de fonte de infecção, da ordem Anseriformes, gansos e patos, e perus (Phasianidae), nas criações intensificadas e com linhagens de maior produtividade são mantidas em galpões industriais com sistema equivaente às galinhas quanto à biossegurança. No Brasil as áreas de produção para estas espécies têm distribuição geográfica bastante restrita, em contraste com as criações países com relatos de surtos, em que se associam as condições de desafio naturais geográficas ditadas pelas rotas migratórias, talvez agravadas ainda mais pela mais alta taxa de replicação de AIV nas aves na estação de residência nos países temperados, além da produção/criação destas espécies nestes países existir em campo aberto em grande número de propriedades. Epidemiologia Diferentes isolados de AIV circulam entre diversas espécies animais ao redor do mundo e embora AIV possa infectar enorme diversidade de espécies das classes de Aves e Mamíferos, são tidas como reservatórios naturais as aves aquáticas, aves habitantes das praias e gaivotas, sendo consideradas não comuns as infecções em galinhas, perus, suínos, eqüinos e humanos (Suarez, 2000). É conseqüência do genoma segmentado, que permite permutações de genes entre isolados, o alto nível de recombinação genética, o que contrasta com o vírus da doença de Newcastle, que não apresenta recombinação detectável por apresentar genoma não segmentado (Kingsbury, 1990). Há baixa replicação de AIV nas aves aquáticas nos períodos migratórios sub-tropicais (Murphy & Webster, 1996), o que pode explicar a baixa ou rara ocorrência no Brasil. As informações sanitárias atualizadas sobre influenza, e todas outras enfermidades de aves classificadas nas listas A e B estão disponíveis na página da Agência Internacional de Epizootias (Office International des Epizooties - OIE http://www.oie.int/esp/info/hebdo/EIS_01.HTM). De acordo com Alexander (2000), as fontes de transmissão para as aves industriais podem ser categorizadas por importância em (1) outras espécies de aves domésticas (p. ex. patos para galinhas); (2) aves de companhia exóticas; (3) aves selvagens e (4) outras espécies animais (por exemplo, suinos para perus). As aves aquáticas da ordem Anseriformes e de praia são consideradas fonte de infecção para as procelárias (Procellariidae, Puffinus sp.; Diomedeidae; Hydrobatidae; Pelecanoididae), gaivotas (Laridae, Larus sp.), passeriformes e mamíferos (Murphy & Webster, 1996). Transmissão AIV são transmitidos principalmente a partir de secreções dos sistemas respiratório e digestório, de ave infectada com manifestação clínica ou não, direta ou indiretamente, esta última especialmente por equipamentos contaminados com fezes (insetos, veículos de transporte, bebedouros, água, comedouros, ração, gaiolas, pessoal por roupas, calçados e botas, etc.). As aves de vida livre infectadas podem transmitir diretamente a infecção ao compartilharem o ambiente de criação. Mutações Os genes que codificam a hemaglutinina e neuraminidase podem apresentar variações pequenas, leves ou sutis que não resultam necessariamente em alterações antigênicas da estirpe quanto ao subtipo de HA e/ou NA (antigenic drift), não significando modificações nos sítios antigênicos relacionados à indução de proteção. Entretanto, estas modificações podem acumular e resultar em mudança do subtipo de HA e/ou NA (antigenic shift), o que ocasiona os surtos de influenza nas populações animais e humanas. As grandes alterações genéticas (shift) podem resultar de mutações, recombinação genética e/ou adaptação ao hospedeiro (seleção natural do AIV viável frente as barreiras da imunidade pré-existente). AIV capazes de apresentar caráter zoonótico têm evoluído de forma constante. Os vírus de influenza de pelo menos duas das últimas pandemias (1918-1919 e 1968) foram caracterizadas como estirpes híbridas que continham genoma recombinante de AIV (de aves) e influenza de humanos. Há evidências, por exemplo, dos vírus H5N1 e H9N2 terem sido transmitidos de aves para humanos nos mercados de aves de Hong Kong (Horimoto & Kawaoka, 2001). Alguns subtipos de AIV têm importância direta em saúde humana. A adaptação a novo hospedeiro significa principalmente alteração rápida das glicoproteínas da superfície, especialmente da hemaglutinina (HA), embora o H5N1 letal aos humanos em Hong Kong em 1997 tivesse a HA altamente adaptada às aves, não necessitando mudanças nesta e que possivelmente os outros genes de outras origens, por recombinação genética, inclusive com seqüências internas de consenso previamente encontradas em humanos (Zhou et al., 1999b). Recombinação genética entre influenza de aves, suínos e humanos foi demonstrada, após episódios de doença respiratória em plantéis de suínos na Carolina do Norte (NC), Texas (TX), Minnesota (MN) e Iowa (IO) em 1998. A hemaglutinina dos quatro isolados obtidos derivou-se de H3N2 humano em circulação em 1995 (Zhou et al., 1999a). Doença Clínica A IA pode resultar amplitude clínica que estende desde infecção subclínica, doença suave respiratória das vias superiores ou doença fatal generalizada em aves domésticas. A variação clínica pode ser conseqüência da espécie hospedeira, por exemplo, os perus e patos são considerados muito sensíveis. No hemisfério norte os episódios de doença, especialmente em perus, têm tido relação com a criação a céu aberto (EUA e Europa), quando há risco maior imposto à espécie, por AIV de aves migratórias. Os sinais clínicos são principalmente percebidos como conseqüência de lesão nos sistemas respiratório, digestório, nervoso e/ou reprodutivo. Em galinhas quadros respiratórios de leves a graves, com estertores, conjuntivite, corrimento nasal, edema da face e cabeça acompanhados ou não de diarréia e/ou quadro nervoso têm sido mais relatados. Em matrizes de frangos de corte criadas próximas de propriedade com patos foram descritos edema subcutâneo, congestão circulatória na cabeça e palidez no músculo do peito. Impacto econômico Para a implantação de programa de erradicação e manutenção deste status, são necessários recursos oficiais ou de fundo específico, permanentes, para atender às despesas técnicas, incluindo a manutenção de estrutura de vigilância com pessoal e equipamentos indispensáveis ao atendimento, isolamento, informação/informatização, diagnóstico e indenização. Para exemplificar, os episódios em Minnesota nos EUA entre 1979 e 1981 resultaram em despesas anuais em torno de 1 milhão de dólares (Davison et al., 1999a; Poss et al., 1982). Os custos com indenizações, diagnóstico, suporte técnico e comando tático na Pennsylvania , com o sacrifício de mais de 11,2 milhões de aves, mais de 7,2 milhões de poedeiras e 3,6 milhões de frangos de corte no programa de erradicação da IA em 1983, somando na Pennsylvania e Virginia US $ 33 milhões (Avian Influenza Task Force, 1984) Zoonose Há recentemente evidências dos vírus H5N1 e H9N2 terem sido transmitidos de aves para humanos nos mercados de aves de Hong Kong (Horimoto & Kawaoka, 2001). O AIV H5N1 que ocasionou óbito de 6 pessoas em Hong Kong (1997) foi transmitido diretamente de galinhas para humanos. As seqüências de aminoácidos de origem humana obtidas por recombinação podem ter importância como determinantes do aspecto zoonótico de H5N1 (Zhou et al., 1999b). Uma estirpe que apresentava múltiplos aminoácidos básicos no sítio de clivagem da HA, caráter associado à alta patogenicidade para galinhas, provocando a mortalidade de 15/16 aves inoculadas de AIV, classificada como A/Hong Kong/156/97 (H5N1) de alta patogenicidade (HPAIV) foi descrita em episódio fatal de influenza em criança com faringite, tosse seca e febre. Mais 12 casos humanos com estirpes de AIV semelhantes foram isoladas, 3 obtidas de casos fatais (Subbarao et al., 1997). Patogênese A terminologia de peste aviária (fowl plague), associada a H7 está sendo abandonada, adotando-se critérios de classificação levando em conta a virulência (especialmente AIV de alta virulência: HPAIV-High Pathogenicity Avian Influenza), conforme as recomendações que seguem: 1. Qualquer vírus de influenza letal a 6, 7 ou 8 de 8 galinhas com 4-6 semanas de idade em um período 10 dias, inoculadas via intravenosa com 0,2 ml de líquido alantóide a 1:10 sem bactérias; 2. Qualquer vírus da influenza dos subtipos H5 e H7 que não atinja o critério acima, mas apresente seqüência de aminoácidos no sítio de clivagem da HA compatível com as estirpes de alta virulência (múltiplos aminoácidos básicos); 3. Qualquer vírus da influenza não integrante dos subtipos H5 e H7 que cause a morte de 1 a 5 das galinhas de 4 a 6 semanas de idade via intravenosa (item 1), em 10 dias e seja replicado em monocamadas celulares na ausência de tripsina (Proceedings..., 1994). No sistema respiratório, as lesões incluem seios paranasais com secreção fibrinosa, mucopurulenta ou catarral, traquéia com edema e secreção de intensidade variável na mucosa, sacos aéreos espessados e com exsudato seroso, fibrinoso ou fibrinopurulento. A IA pode ocasionar ovoposição ectópica em poedeiras, que pode evoluir para peritonite por ovo ectópico e por contigüidade dos sacos aéreos (aerossaculite). Poedeiras podem ainda apresentar salpingite com acumulação de exsudato no oviduto. Enterite hemorrágica, fibrinosa (formas graves) ou catarral (formas leves) pode ser observada e é mais comum em perus no intestino delgado e cecos. Diagnóstico A confirmação do diagnóstico de influenza aviária só é possível com exame laboratorial e depende do isolamento e identificação do vírus, uma vez que os sinais clínicos e lesões são muito variáveis entre os episódios. O quadro clínico e patológico varia com a estirpe de AIV e das características do hospedeiro, como espécie de ave, estado imune específico e não específico, estado nutricional, doenças concomitantes etc. O isolamento e identificação viral devem seguir as normas previstas pela O.I.E. e por centros internacionais de referência para influenza. No Brasil deve ser confirmado pelo LARA (Laboratório de Referência Animal do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento- MAPA) em Campinas, São Paulo. O diagnóstico diferencial para a distinção de IA de outras enfermidades de quadro clínico e patológico semelhante é sempre necessário, especialmente para doença de Newcastle, cólera aviária, micoplasmoses e clamidiose. A bacteriologia complementar e diferencial deverá ser atendida. Isolamento de identificação do vírus O exame laboratorial pode ser encaminhado para virologia (e bacteriologia complementar/diferencial) aos laboratórios privados ou oficiais credenciados pelo MAPA. A confirmação oficial dependerá de amostragem oficial, efetuada por fiscais do MAPA ou Médicos Veterinários autorizados. Os isolados suspeitos devem ser caracterizadas no Laboratório de Referência Animal (LARA, Campinas) e, se necessário, a amostragem oficial implementada. Alguns detalhes de amostragem e atenção ao foco estão descritos no capítulo sobre o Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA). O PNSA está implantando o projeto de vigilância ativa da doença de Newcastle e influenza aviária, para o qual os abatedouros receberão materiais (kit) para a colheita de amostras, incluindo frascos, etiquetas, canetas, sacos plásticos, seringas, swabs, fitas colantes, gelo reciclável e caixa isotérmica de transporte (Projeto de Vigilância..., 2001). A literatura de prática laboratorial em doenças das aves descreve a metodologia de coleta, preservação, envio e processamento laboratorial para o cultivo nos substratos apropriados. Muitos tecidos e secreções das aves infectadas ou doentes são fonte de vírus para replicação e isolamento em laboratório. Os tecidos recomendados para amostragem refletem o quadro clínico ou sistemas mais comumente atingidos pela infecção, principalmente sistema respiratório e digestório. As estirpes de HPAIV têm grande amplitude de tropismo infeccioso e atingem virtualmente todos os tecidos e de quaisquer tecidos podem ser isoladas. Altos títulos de excreção fecal, que garantem alta transmissibilidade de aves reservatório para domésticas, permitem o isolamento dos AIV das fezes ou por amostragem cloacal (swabbing). A infecção respiratória por sua constância permite freqüente sucesso de isolamento da região nasofaríngea (por exemplo, fenda palatina) e da traquéia, mesmo na ausência de sinais clínicos (Easterday et al., 1997). Os substratos celulares e animais de laboratório devem ser livres de patógenos e anticorpos específicos - SPF (specific pathogen free), entre estes os mais comuns são ovos embrionados, pintinhos e frangas/frangos e galinhas (Gallus gallus formadomestica). Outros hospedeiros experimentais são os perus Meleagris gallopavo formadomestica) e patos (Anas) são utilizados. AIV também são replicados em mamíferos como marta (ferret) e vison (mink) (mustelídeos, marta Mustela putorius e vison Mustela vison), camundongos, hamsters, gatos e suínos. Embriões de galinhas SPF podem ser inoculados entre 9 e 11 dias de incubação via cavidade alantóide com material de macerado de tecidos ou excreções tratados com antibióticos e antimicótico. Os líquidos alantóides (LA) dos embriões vivos, mortos ou com alterações de desenvolvimento em até sete dias após a inoculação são examinados para atividade hemaglutinante (HA) misturando-se LA e hemácias de galinhas SPF a 5% (50 ìl de cada), com a hemaglutinação visível pela formação de grumos. O agente com atividade HA no LA é caracterizado em testes para a identificação de influenza A em reação contra anticorpos específicos para a NP (imunodifusão e precipitação em gel de ágar – AGP), de inibição da hemaglutinação com anticorpos policlonais ou monoclonais específicos contra cada subtipo de AIV e para diferencial do vírus da doença de Newcastle (VDN). Cultivos primários de fibroblastos, rins e fígado de embriões SPF são também substratos para o cultivo de AIV, os quais estirpes patogênicas podem infectar sem tratamento enzimático prévio (glicoproteína da fusão - em HA2 - ativada dentro da célula, no complexo de Golgi), enquanto estirpes não patogênicas necessitam tratamento prévio com tripsina em pH ácido, para a ativação da glicoproteína da fusão. Cultivos de órgãos, como anéis de traquéias, são também substratos que permitem o isolamento e o desenvolvimento de ensaios de caracterização específica do subtipo (neutralização da HA ou NA) sem necessidade de adaptação. Diagnóstico sorológico Testes de gel-precipitação (imunodifusão), inibição da hemaglutinação, inibição da neuraminidase ou imunoenzimáticos (ELISA) podem ser empregados para a monitorização sorológica. ELISA em kits comerciais estão disponíveis para a detecção de anticorpos contra a nucleoproteína (NP) de AIV do tipo A e outros para a caracterização quanto ao subtipo de AIV (HA) durante a identificação de estirpes. Detalhes dos ELISA comerciais, da a interpretação dos resultados e do uso de programas de plotagem e análise estatística estão descritos nos manuais dos fabricantes. A detecção de anticorpos contra a NP permite a demonstração de contato prévio com AIV do tipo A, grupo em que estão todos os AIV. A caracterização da resposta quanto à especificidade dos anticorpos para as diversas HA existentes (subtipos) é mais complexa e pode requerer um ensaio de captura de glicoproteína de cada subtipo (H1 a H15) e/ou anticorpos monoclonais. Variações na intensidade da resposta imune natural para a NP foram detectadas, conforme a espécie de ave, sendo os títulos em patos muito baixos ou não detectáveis em comparação com altos títulos em perus e faisões (Easterday et al., 1997). O PNSA no projeto de vigilância ativa da doença de Newcastle e influenza aviária (Projeto de Vigilância..., 2001) prevê, para a certificação do estado de país livre, a amostragem, na linha de abate, de 24 aves por lote para a sorologia, colhendo-se 2 a 3 ml de sangue por ave individualmente em tubos de plástico estéreis e os soros separados, centrifugados e congelados. Diagnóstico e Identificação por Genética Molecular Métodos da biologia molecular para a detecção e caracterização do genoma de AIV têm sido descritos na literatura, para a detecção por exemplo, de região conservada do gene da nucleoproteína (N) e/ou matriz (M1 e/ou M2), garantindo o diagnóstico amplo de quaisquer estirpes de quaisquer subtipos do tipo A. Ensaios para a detecção de seqüências genômicas que codificam as glicoproteínas do envelope têm a vantagem de permitir a classificação quanto ao subtipo (HA e NA) e a desvantagem de resultados falso-negativos, contornáveis em parte pela utilização de iniciadores para os principais subtipos já diagnosticados. Medidas de Controle Vacinas Nos Estados Unidos o controle de HPAIV tem sido implantado com programas de erradicação, a mesma estratégia para as formas velogênicas do vírus da doença de Newcastle (Villegas, 1998). Prevenção da exposição, biossegurança, vigilância epidemiológica e diagnóstico, educação, quarentena e depopulação são ações fundamentais. Novas estirpes de vírus influenza estão constantemente emergindo na população humana e animal, o que dificulta a atualização das vacinas. Algumas tentativas de vacinação foram integradas a programas de controle e erradicação de AIV. Entretanto, métodos de controle que contam com a ocorrência de infecção baixa nos plantéis não são aceitáveis por geração de oportunidade de mutação e recombinação dos vírus prevalentes. HPAIV não são encontrados com freqüência infectando aves aquáticas selvagens reservatório, estas aves são portadoras de AIV de baixa patogenicidade, que cruzam as barreiras específicas de hospedeiros, ocasionando doença leve em aves domésticas e podem evoluir para HPAIV por mutações ou recombinação da HA. As estirpes de HPAIV de surtos em aves domésticas são, entretanto, comumente isoladas de aves selvagens durante o surto (Swayne & Suarez, 2000), o que indica para o possível retorno dos AIV recombinantes/mutantes para estas. A proteção derivada de vacina recombinante ou inativada homóloga ao AIV de desafio, foi eficaz para sinais clínicos e mortalidade e reduziu o número de aves e o título da excreção viral. A mudança genética suave (drift) não interferiu na proteção geral, embora tenha sido descrita para vírus humanos. As vacinas inativadas do subtipo H5 contendo vírus íntegro, hemaglutinina expressa em baculovírus ou recombinante em pox galinha expressando hemaglutinina foram eficientes em induzir proteção ao desafio com múltiplas estirpes de HPAIV de H5 de quatro continentes, de seis espécies hospedeiras diferentes e obtidas em um período de 38 anos. (Swayne et al., 2000b). Todas dez HA avaliadas em vacinas têm resultado em proteção contra doença e mortalidade, após desafio homólogo, com anticorpos detectados por IH e imunodifusão em ágar. Por exemplo, grupos de galinhas de 4 semanas de idade foram vacinados com HA de uma estirpe do subtipo H5, uma heteróloga H7 ou líquido alantóide (controle) e desafiados com uma estirpe de HPAIV H5. (Swayne et al., 1999). Uma vacina recombinante de pox galinha expressando a hemaglutinina de HPAIV do subtipo H5 foi aplicada após uma vacina de bouba e teve sua eficiência limitada em aves previamente imunizadas contra a bouba aviária (Swayne et al., 2000a). Adjuvante de Bifidobacterium breve foi descrito para vacinas em camundongos, nos quais houve melhor uniformidade da expressão de anticorpos na mucosa e proteção às portas de entrada (Yasui et al., 1994). Houve proteção de 90-100% (contra a doença clínica e mortalidade) ao desafio após a aplicação de uma vacina recombinante de vírus da bouba das galinhas contendo o gene da HA do subtipo H5. Após o desafio com HPAIV H5N2 isolada de galinhas entre 3 e 20 semanas pós-vacinação, houve redução entre 50 e 75% da excreção intestinal e respiratória do AIV, assim como redução da transmissão por contato (Swayne et al., 1997). A vacina foi aplicada em pintinhos de 1 dia e nenhum pintinho apresentou conversão sorológica, não interferindo com o programa de monitorização sorológica por imunodifusão em ágar de rotina para AIV dos EUA, mas com 8% de positividade de baixos títulos em IH (Swayne et al., 1997). A proteção foi total ao desafio com estirpe de alta virulência do subtipo homólogo (H5 ou H7), com nenhuma ou reduzida excreção de vírus já em 3 dias após o desafio, após a vacinação com vacina recombinante contendo H5 ou H7. A vantagem da ausência de resposta imune aos demais componentes estruturais dos AIV permite a diferenciação das respostas imunes derivadas da vacina recombinante e infecções naturais por AIV (Crawford et al., 1999). Uma preparação de vacina recombinante expressando uma inserção de H5 em vírus da bouba aviária protegeu galinhas contra sinais clínicos, mortalidade e excreção de vírus após o desafio com HPAIV. As comparações das seqüências deduzidas de aminoácidos da HA indicaram que houve drift antigênico no AIV excretado pós-desafio (Swayne et al., 2000a), resultado que alerta para o risco da imunidade provocar seleção de mutantes. A produção de vacinas para as estirpes de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) esbarra na virulência destas para o embrião, resultando em mortalidade muito precoce e baixos títulos, assim como na necessidade de rigorosa biossegurança laboratorial (Takada et al., 1999). Uma vacina de ISCOM (immune stimulating complex) induziu imunidade protetora enquanto a preparação de vacina com subunidades e não adjuvantada não resultou em proteção ao desafio homólogo (Rimmelzwaan et al., 1999). Vacinação in ovo foi descrita para AIV. Embriões (White Leghorn-WL ou White Rock-WR) de 18 dias de embriogênese foram vacinados com vacina oleosa contra AIV in ovo em vários volumes e concentrações de antígeno e anticorpos séricos IH foram detectados a partir de duas semanas pós-eclosão entre 85 e 100% dos pintinhos, com proteção ao desafio com AIV de alta patogenicidade aos 34 dias de idade. A eclodibilidade dos embriões inoculados com 100 ìl de vacina não foi diferente dos embriões controles (Stone et al., 1997). Biossegurança As estratégias de biossegurança são essenciais para a redução da disseminação de doenças infecto-contagiosas, entre estas, influenza, reduzindo as despesas com medicação e melhorando a qualidade dos produtos. A implementação destas estratégias, além da atenção aos focos, conforme recomendada pela O.I.E. para a erradicação das doenças da lista A, nos episódios ocorridos na avicultura industrial americana (Davison et al., 1999; Avian Influenza Task Force, 1984; Lasley, 1987), européia (Capua & Marangon, 2000) e asiática (Wei-Hua, 1998) impediu maiores prejuízos econômicos. A avicultura industrial deve ser planejada para impedir a concentração de granjas em área geográfica com proximidade e multiplicidade de idades e tipos de aves. O controle de AIV em regiões de avicultura densamente povoadas é difícil, especialmente onde já existe estirpe de HPAIV circulando e disseminada. Desinfetantes Produtos anticongelantes têm sido avaliados em países com invernos frios para reduzir o risco de congelamento e preservação da atividade virucida contra o AIV. Compostos fenólicos e quaternário de amônia puros foram eficientes enquanto a solução em etileno-glicol de amônia quaternária-formaldeído (AF) e o hipoclorito de sódio foram afetadas, este também afetado em propileno glicol. Um produto anticongelante de parabrisas comercial manteve a eficácia de todos os desinfetantes exceto a combinação AF (Davison et al., 1999b). Peróxido de hidrogênio em vapor foi avaliado na desinfecção de AIV e outros vírus exóticos, em cabine de descontaminação em unidades de isolamento, sem efeitos adversos sobre os equipamentos (Heckert et al., 1997). Tratamento Estão atualmente autorizados nos EUA para uso na profilaxia e terapêutica de influenza A o hidrocloreto de amantadina e a rimantadina, indicadas na concentração entre 0,2 e 0,4 ìg/ml. Ambas drogas agem após a adsorsão viral e antes da replicação primária e progênie virais resistentes podem ser isoladas in vivo e in vitro. Estirpes de alta patogenicidade resistentes à amantidina são transmitidas para hospedeiros sensíveis sem redução da virulência. O mecanismo primário de ação de amantidina e rimantadina é baseado na interrupção do fluxo de íons H – dos endossomas acidificados para dentro do vírion (poro iônico M2), um processo necessário para a liberação do complexo de nucleoproteína e ácido nucléico, que é transportado ao núcleo para transcrição (Murphy & Webster, 1996). O ácido 4 - guanidino - 2-4 - dideoxy - 2,3 - didehydro -N- acetilneuramínico (4-guanino-Neu5Ac-2en), Zanamavir, GG167, um inibidor específico da neuraminidase dos vírus influenza, em avaliações in vivo não apresentou efeito profilático embora tenha retardado o surgimento de febre e mortalidade em ensaios com apenas uma estirpe e não em duas outras de AIV. Experimentos com a droga amantidina, bem estabelecida como antiviral para influenza, têm produzido inibição da febre e mortalidade em aves desafiadas via intratraqueal. A aplicação e ação local de drogas antivirais, entretanto, não impede a disseminação do vírus para sítios não atingidos pela droga (McCauley et al., 1994; Thomas et al., 1994). Oligopeptídeos com seqüências de aminoácidos semelhantes ao N-terminal do polipeptídeo HA2 têm atividade antiviral in vitro. Outra estratégia emprega análogos do ácido siálico, os quais diminuem a taxa de replicação dos influenza vírus por impedirem a remoção do ácido neuramínico dos receptores da superfície da célula e do envelope do vírus. O sítio de reação do ácido siálico na NA tem a conformação de uma bolsa para cada uma das quatro subunidades, nas quais os aminoácidos são conservados para todos os infuenza vírus (A e B). Dois compostos (4-amino ou 4 guanidino ácido 2-deoxy-2,3 didehidro-D-N-acetilneuraminico e 4-amino ou guanidino-Neu 5Ac2en) são altamente eficientes inibidores da NA de influenza vírus. A e B. Entretanto, a geração de resistência tem sido preocupante, uma vez que a bolsa da NA não parece ser essencial para o substrato natural (ácido siálico) e vírions mutantes sem a cavidade podem eliminar a ação de bloqueio sobre a NA (Lamb & Krug, 1996). Vírus produzido em células cultivadas na presença de inibidores da neuraminidase não tem a remoção do ácido siálico aderido à HA, NA e receptores da superfície da célula, inibindo a atividade de adsorção do HA do vírus e receptor celular. Algumas drogas são desenhadas com o auxílio de computação gráfica para definir, por exemplo, precisamente os sítios relevantes na associação neuraminidase-ácido siálico (Lamb & Krug, 1996). O interferon tem sido avaliado para a terapia anti-AIV. Entretanto AIV pode desenvolver resistência temporária ao interferon (IFN) alfa em parte da população viral quando cultivado em células de galinha (Gallus) ou codornas (Coturnix) enquanto o restante permanece sensível (Sekellick et al., 2000). 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