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Quarta-feira, 22/01/2020
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CIÊNCIA & TECNOLOGIA - Trabalhos Técnicos

Saúde Avicola

Tipificação Genômica de Mycoplasma gallisepticum por Amplificação Polimórfica Randomica de DNA (RAPD)

E. Mettifogo M. R. Buim A. J. P. Ferreira M. Buzinhani J. Timenetsky Introdução Mycoplasma gallisepticum (MG) provoca a doença crônica respiratória (DCR) nas galinhas e sinusite infecciosa dos perus, sendo considerado uns dos maiores responsáveis por prejuízos econômicos à indústria avícola. O controle desta doença é realizado por meio de medidas de biossegurança, tratamentos dos lotes infectados e vacinação. A vacina MG-f atenuada ainda é muito utilizada, principalmente nas poedeiras. Eventualmente, esta vacina pode reverter para a forma patogênica e causar infecções. Além disso, os testes sorológicos utilizados na rotina, não distinguem os anticorpos vacinais daqueles originados de infecção natural. Em conseqüência disso, a vacinação não é permitida em aves reprodutoras. A técnica de RAPD tem sido utilizada para estudos epidemiológicos entre organismos correlacionados ou para diferenciar cepas de uma mesma espécie, detectando polimorfismos (1,2). Esta técnica utiliza primers escolhidos aleatoriamente e não exige o conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos do DNA alvo. O perfil das bandas geradas é o resultado da hibridação do primer a seqüências específicas e da amplificação da região flanqueada por estas. A análise visual dos esferogramas possibilita a diferenciação entre as cepas, não sendo possível uma análise de similaridade entre as cepas. Neste trabalho, alem da otimização dos parâmetros e do teste de diversos primers e ciclos para a RAPD, foram utilizados modelos matemáticos, com o objetivo de melhorar a análise de similaridade entre as cepas de referência, cepas de vacinas e isolados de campo de MG. Material e Métodos Cepas de MG utilizadas: 5969, s6, i, r, a, ts-11 e f (vacinais); isolados de campo identificados previamente como MG-f pela PCR com primers específicos (3): 1a, 1b, 1c, 1d, 36, 88 e 93. A extração do DNA cromossomal foi realizada pelo método de fervura (1). Inicialmente, os parâmetros de amplificação foram otimizados: concentração de DNA alvo, tampão da reação, MgCl 2 , dNTPs, Taq DNA polimerase (Gibco) e primer. Dois ciclos de amplificação com variações de temperatura de anelamento foram testados. O perfil dos fragmentos foi fotografado e analisado pelo Sistema de Foto Documentação Vilber-Lourmat, o qual calcula o peso molecular dos fragmentos. Após a padronização do RAPD, foram testados 27 primers. O dendograma foi extraído pela análise por UPGMA com coeficiente de Jaccard. Resultados e Discussão Dos 27 primers testados, o 1254 (2) apresentou os melhores resultados. Observa-se pelo dendograma a separação das cepas em grupos (clados). A cepa vacinal MG-f e os isolados identificados como cepa f foram agrupados em um mesmo clado. Os isolados obtidos de um mesmo embrião de incubatório, a partir de pulmão (1a), sacos aéreos (1b), traquéia (1c) e articulação (1d) foram classificados como idênticos, enquanto que os isolados de outros embriões do mesmo incubatório (2 e 4), foram similares entre si, mas com pequena divergência, permanecendo no mesmo clado. Os isolados 36, 88 e 96, provenientes de uma granja de poedeiras com histórico de vacinação, apresentaram maior similaridade com a cepa F vacinal. Figura 1. Dendograma mostrando a análise da similaridade por UPGMA entre as cepas e isolados de MG. Conclusão O método de RAPD e a análise por modelos matemáticos apresentaram capacidade discriminatória e podem ser aplicados em estudos epidemiológicos sobre as relações ou a diversidade genética de cepas de MG. Bibliografia 1. Fan HH, Kleven SH, Jackwood MW. Avian Diseases 1995; 39: 729-735. 2. Geary SJ, Forsyth MH, Aboul Saoud S, Wang G, Berg, DE, Berg CM Molecular Cellular Probes 1994; 8: 311-316. 3. Nascimento ER, Yamamoto R, Khan MI. Avian Diseases 1993; 37: 203-211.


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