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CIÊNCIA & TECNOLOGIA - Trabalhos Técnicos

Saúde Avicola

Resposta Imune Humoral de Poedeiras Imunizadas com Proteína Recombinante ISS de Escherichia Coli Patogênica para Aves (Apec).

AAS. Baptista1; RKT. Kobayashi2; MC. Vidotto3; 1- Mestranda e Executora DMVP/UEL, PR. 2-Docente e Pesquisadora / Departamento de Microbiologia / CCB / UEL, PR. 3- Docente e Pesquisadora / Departamento de Medicina Veterinária Preventiva / DMVP /CCA/ UEL, PR. INTRODUÇÃO Escherichia coli é o agente responsável pela colibacilose aviária, a qual é uma das principais causas de prejuízos econômicos na avicultura industrial moderna, decorrente do aumento da mortalidade, custos com tratamento e condenação de carcaças no abatedouro (1). A patogenicidade das amostras de APEC esta relacionada com a presença de um ou mais fatores de virulência (2), sendo o principal fator, a proteína Iss, codificada pelo gene iss (increased serum survive), que confere resistência ao sistema complemento, aumentando sua resistência às defesas imunológicas do organismo (5, 7). O objetivo deste trabalho foi inocular a proteína recombinante Iss em galinhas poedeiras e avaliar a resposta imune humoral. MATERIAL E MÉTODO O DNA total da amostra de E. coli APEC 9 foi extraído e o gene iss amplificado pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Em seguida foi realizada a clonagem do gene no vetor pETSUMO e a subclonagem no vetor pET 30, a bactéria E. coli Topo10 foi transformada com a mistura de ligação e a presença do gene iss foi confirmada pela técnica da PCR. O plasmídio recombinante pET 30/iss foi purificado e caracterizado por digestão com enzima de restrição. A bactéria E. coli BL21 (DE3) foi transformada com o plasmídio pET 30/iss e a expressão da proteína foi induzida pela adição de IPTG 1mM. Uma proteína de 11kDa, correspondente a proteína Iss foi expressa e purificada através de cromatografia por afinidade ao metal imobilizado (Qiagen). Para o ensaio foram utilizadas duas galinhas poedeiras Hy Line, com 20 semanas de idade, alojadas em gaiolas individualizadas, recebendo água potável e ração de postura ad libidum. Cada ave foi imunizada com 100g da proteína recombinante Iss (r-Iss) emulsificada com iscomatrix adjuvante, via intramuscular, sendo realizada três imunizações com intervalos de 15 dias. Os ovos pré e pós imunização foram coletados diariamente e armazenados a 4°C para posterior avaliação da resposta imune humoral pelo teste de Elisa indireto. Para este teste uma placa de poliestireno com 96 orifícios foi sensibilizada com r-Iss e incubada overnight a 4ºC. No dia seguinte foi lavada com solução de lavagem (PBS com 0,05% de Tween 20) e bloqueada com PBS-Leite 5% por uma hora. As gemas dos ovos dos dias 0, 7,14, 21 e 28 foram diluídas em PBS-Leite 1% (1:500), distribuídas em duplicata na placa (100l/poço) e esta incubada a 25ºC por uma hora. Logo após, a placa foi lavada com solução de lavagem e submetida à incubação com anticorpo secundário (anti-chicken), na diluição de 1:40.000. A seguir a placa foi novamente lavada, e então acrescentado o substrato cromogênico (TMBZ e peróxido de hidrogênio) diluído em tampão acetato. Passados 15 minutos, a reação foi bloqueada com H2SO4 1N, e a leitura realizada em espectofotômetro de microplacas, com filtro de 450nm. RESULTADOS E DISCUSSÃO O resultado obtido pelo teste de Elisa indireto, realizado com a gema dos ovos das galinhas imunizadas com a proteína recombinante Iss, nas semanas 0, 1, 2, 3 e 4, demonstrou que houve resposta efetiva a imunização (Figura 1), e que o pico de produção de anticorpos foi ao redor da quarta semana, corroborando com outros trabalhos (3). Estes resultados demonstram que a proteína recombinante Iss, estimula a produção de anticorpos nas aves, como observado por outros autores (4, 5, 6), e sugere sua pesquisa como vacina de subunidade em estudos futuros.



Figura 1. Detecção da Produção de anticorpos da classe IgY, por meio do método de Elisa, após a imunização de galinhas com proteína Iss recombinante.

CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que a proteína recombinante Iss estimula a produção de anticorpos da classe IgY e em virtude disto, surgem perspectivas promissoras no estudo da mesma. BIBLIOGRAFIAS 1. Barnes, H. J.; Gross, W. B.; Vallancourt, J. -P. Colibacillosis. In: Diseases of poultry. 11th ed. Saif, Y. M.; Barnes, H. J.; Glission, J. R.; Fadly, A. M.; McDougald, L. R.; Sayne, D. E. Iowa State University Press, Ames, IA. p.270-278, 2003. 2. Johnson, J. R. Virulence factores in Escherichia coli urinary tract infection. Clinical Microbiology Rev, n.4, p.80-128, 1991. 3. Kariyawasam, S.; Wilkie, B. N.; Gyles, C. L. Resistance of broiler chickens to Escherichia coli respiratory tract infection induced by passively transferred egg-yolk antibodies. Veterinary Microbiology.v.98, p.273-284, 2004. 4. Lynne, A. M.; Foley, S. L.; Nolan, L. K. Immune response to recombinant Escherichia coli Iss protein in poultry. Avian Diseases, v. 50, p.273-276, 2006a. 5. Lynne, A. M.; Foley, S. L.; Norlan, L. K. Characterization of monoclonal antibodies to avian Escherichia coli Iss. Avian Diseases, v.50, p.445-449, 2006b. 6. Lynne, A. M.; Skyberg, J. A.; Logue, C. M.; Nolan, L. K. Detection of Iss and Bor on the surface of Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology, v.102, p.660-666, 2007. 7. Vidotto, M. C.; Müller, E. E.; De Freitas, J. C.; Alfieri, A. A.; Guimarães, I. G.; Santos, D.S. Virulence factors of avian Escherichia coli. Avian Diseases, v.34, p.531-538, 1990.


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